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Reporte del ensamble y andamiaje del genoma de Trichoderma atroviride IMI206040 con lecturas PacBio e Illumina

Reporte del ensamble y andamiaje del genoma de Trichoderma atroviride IMI206040 con lecturas PacBio e Illumina

• Se inició el proceso de re-secuenciación del genoma de Trichoderma atroviride IMI206040 con 12 bibliotecas PacBio.
• Se determinó la longitud y %G+C de las lecturas de cada biblioteca, observando que no todas las reacciones de secuenciación contaban con rendimientos adecuados, estimado como número de lecturas y longitud de las mismas

Biblioteca	Reads	Longitud máxima	Longitud media	Información
24D1	6005713	87962	1893.66	plot
24D2	1421683	116707	7015.09	plot
24D3	1645852	104870	6897.54	plot
30D1	8177858	83868	1756.11	plot
30D2-long	1046360	107468	7064.06	plot
30D2-short	1396560	62193	2323.17	plot
30D3-1	11020	117565	3284.33	plot
30D3-2	4087	72870	2410.4	plot
CR1_short	359360	76353	4172.8	plot
CR2_long	1304985	117056	6919.88	plot
CR2_short	2804001	99115	3242.37	plot
CR3_long	1509190	115974	6718.48	plot

Para el ensamble inicial se consideraron unicamente las lecturas de las bibliotecas CR1, CR2 y CR3, se empleó el programa Canu v1.8 [ref], obteniendo un ensamble que fue ordenado manualmente con base en similitud con el genoma de Trichoderma reesei QM6A [ref]. Este ensamble (referido como scf) mostró una contigüidad adecuada, logrando obtener 8 scaffolds correspondientes a los cromosomas de Trichoderma atroviride. No obstante, al mapear datos provenientes de RNAseq, se obtuvo una fracción elevada de lecturas no mapeadas que si lograban ser alineadas al genoma de referencia, específicamente a la secuencia correspondiente al contig_18.

Con base en esta información, se procedió a reensamblar el genoma de Trichoderma atroviride IMI 206040 y de pulir dichos ensambles con lecturas Illumina y PacBio.

Preparación de un set de lecturas PacBio de alta calidad para el pulido de los ensambles obtenidos

Se emplearon únicamente las lecturas provenientes de las bibliotecas 24D2, 24D3, 30D2-long, CR2_long y CR3_long, mismas que fueron concatenadas, obteniendo ~ 45 Gbp para una profundidad aproximada de 1000X.

Posteriormente las lecturas seleccionadas fueron sometidas a un proceso de corrección empleando Canu [ref].

Generación de ensambles alternativos

Una vez que se obtuvo el dataset de lecturas corregidas, se procedió a la construcción de 3 ensambles adicionales, v3 empleando wtdbg2 [ref], v3.2 empleando Canu [ref] y v3.3 empleando racon [ref]. Las estadísticas de dichos ensambles son las siguientes:

Metric	v1	scf	v3	v3.2	v3.3
Assembly length	36.1437	36.3064	45.2236	36.3359	43.4588
Longest contig	5.62178	6.6475	4.69221	5.64224	3.58511
Contig count	29	23	482	24	322
Assembly n50	2.0079	5.65082	1.5878	2.135	1.50516
Contigs >1e6 bp	15	8	12	14	16
Length >1e6 bp	33.1471	36.1388	27.4887	33.4079	29.6941
Contigs >1e5 bp	20	8	29	18	31
Length >1e5 bp	36.061	36.1388	36.6339	36.2242	36.419
Contigs >1e4 bp	22	19	363	24	320
Length >1e4 bp	36.0967	36.2807	44.5593	36.3359	43.4453

Pulido de los ensambles generados

Los ensambles generados fueron pulidos con lecturas PacBio empleando racon [ref], y con lecturas Illumina empleando ntedit [ref].

Los ensambles obtenidos tras pulir con lecturas PacBio fueron nombrados pb-polish, mientras que los ensambles pulidos con lecturas Illumina fueron nombrados ilm-polish, adicionalmente se realizaron pulidos dobles, con lecturas PacBio e Illumina denominados pb-ilm-polish.

Evaluación de los ensambles usando lecturas Illumina de DNAseq

Para determinar el efecto de las distintas estrategias de pulido, así como la calidad propia de los nuevos ensambles obtenidos, se emplearon lecturas Illumina de DNAseq, las cuales fueron alineadas a las secuencias generadas. Posteriormente se determinó que fracción de dichas lecturas alineaba adecuadamente a las secuencias (samtools view -f3) y que fracción de las lecturas no fue alineada (samtools view -f12). Dichas fracciones fueron calculadas tanto para los ensambles generados como para el ensamble de referencia. Asimismo, se determinó que lecturas había en común entre los alineamientos de cada secuencia generada y los alineamientos del genoma de referencia, es decir, cuanto mayor fuera el porcentaje de lecturas adecuadamente pareadas entre el alineamiento de los nuevos ensambles y el alineamiento del genoma de referencia, menos información se estaría perdiendo para dicho ensamble. Del mismo modo, cuanto menor fuera el porcentaje de lecturas compartidas no adecuadamente pareadas, menos información se estaría perdiendo en los nuevos ensambles.

Sequence	Status	Unmapped read pairs	Shared	Unique	%Shared	%Unique	Properly mapped read pairs	Shared	Unique	%Shared	%Unique
Trichoderma atroviride v1	raw	1747356	-	-	-	-	-	-	-	-	-
Trichoderma atroviride scf	raw	1887134	1730276	156858	99.02	8.31	14674710	14654290	20420	97.82	0.14
	Pb-polish	1887852	1730252	157600	99.02	8.35	14673524	14652466	21058	97.81	0.14
	Ilm-polish	1887236	1730660	156576	99.04	8.30	14674120	14654272	19848	97.82	0.14
	Pb-ilm-polish	1887830	1730424	157406	99.03	8.34	14673194	14652436	20758	97.81	0.14
Trichoderma atroviride v3	raw	1880944	1729154	151790	98.96	8.07	14685178	14663290	21888	97.88	0.15
	Pb-polish	1877492	1723216	154276	98.62	8.22	14688178	14660288	27890	97.86	0.19
	Ilm-polish	1882324	1730530	151794	99.04	8.06	14684120	14663406	20714	97.88	0.14
	Pb-ilm-polish	1878088	1723746	154342	98.65	8.22	14687756	14660338	27418	97.86	0.19
Trichoderma atroviride v3.2	raw	1534676	1534292	384	87.81	0.03	15219110	14978430	240680	99.98	1.58
	Pb-polish	1535208	1534812	396	87.84	0.03	15218650	14978414	240236	99.98	1.58
	Ilm-polish	1535076	1534754	322	87.83	0.02	15219546	14979136	240410	99.99	1.58
	Pb-ilm-polish	1535124	1534982	142	87.85	0.01	15219434	14979214	240220	99.99	1.58
Trichoderma atroviride v3.3	raw	1554104	1535082	19022	87.85	1.22	15194030	14955302	238728	99.83	1.57
	Pb-polish	1554076	1535072	19004	87.85	1.22	15194452	14955874	238578	99.83	1.57
	Ilm-polish	1553850	1535104	18746	87.85	1.21	15193558	14955598	237960	99.83	1.57
	Pb-ilm-polish	1553740	1535008	18732	87.85	1.21	15194692	14956034	238658	99.83	1.57

Evaluación de los ensambles usando lecturas Illumina de DNAseq

Para evaluar el efecto de las rondas de pulido, se procedió a determinar el número de lecturas RNAseq (Illumina) que no lograron ser alineadas a los ensambles obtenidos pero que si podían ser alineadas a los contigs presentes en el ensamble de referencia. A continuación se muestran los resultados obtenidos:

Contig	Length	scf				v3				v3.2				v3.3
		raw	pb-polish	ilm-polish	pb-ilm-polish	raw	pb-polish	ilm-polish	pb-ilm-polish	raw	pb-polish	ilm-polish	pb-ilm-polish	raw	pb-polish	ilm-polish	pb-ilm-polish
contig_1	4710	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
contig_2	3162	116	83	116	83	0	1	0	0	116	0	0	0	0	0	0	0
contig_3	9774	330	330	330	330	330	330	330	330	330	330	330	330	330	330	330	330
contig_4	4483	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
contig_5	8316	618	618	618	618	618	618	618	618	2996	4	4	4	4	4	4	4
contig_6	7936	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
contig_7	8555	42	42	42	42	42	42	42	42	208	0	0	0	0	0	0	0
contig_8	10219	1374	15	852	15	16	16	16	16	10182	5	5	5	9	9	9	9
contig_9	25523	100	101	100	101	29	31	29	31	362	0	0	0	362	362	362	362
contig_10	205695	2	3	2	3	41	41	41	41	12721	6	7	6	89	85	84	85
contig_11	311306	42	39	40	39	226	223	223	223	99862	224	225	224	7659	7660	7658	7659
contig_12	487615	40	38	38	38	447	375	375	375	130055	365	365	365	81	44	42	43
contig_13	911962	960	978	952	973	971	967	961	961	319584	178	178	173	1007	1057	954	961
contig_14	997338	239	245	239	240	102	117	100	100	269672	129	112	112	818	876	791	834
contig_15	1127681	205	223	204	205	181	526	165	166	404067	1015	996	992	237	165	155	148
contig_16	1160020	1192	1273	1189	1197	159	247	157	155	403023	233	209	209	274	289	271	285
contig_17	1474880	243	288	238	262	301	234	227	226	569309	396	308	316	1717	1746	1711	1724
contig_18	1417455	567707	527567	567700	526548	567048	527110	567042	526971	2475587	357415	357539	357447	2160	2226	1822	2100
contig_19	1567605	286	268	260	258	414	479	387	410	618119	2531	1867	2502	459	431	374	355
contig_20	1588798	1681	1580	1573	1573	1596	1660	1588	1592	538456	1208	1170	1196	1632	1621	1616	1615
contig_21	1650603	151	201	147	151	1243	1250	1238	1238	397650	1206	1171	1183	378	364	304	326
contig_22	1899297	599	628	793	793	340	368	519	516	701998	506	647	649	494	487	677	676
contig_23	2124193	404	295	391	284	1460	1507	1449	1453	504712	288	271	266	1522	1490	1481	1482
contig_24	2790066	489	497	465	467	2887	3001	2861	2909	961547	638	582	578	673	581	603	533
contig_25	3049622	613	760	545	593	3379	3408	3330	3326	1040010	3271	3240	3243	707	783	646	688
contig_26	4122911	2171	2155	2094	2097	2298	2375	2214	2289	1166844	6337	6187	6177	707	809	570	558
contig_27	5621775	5873	5965	5815	5894	1112	1116	1049	1054	1948214	2501	2252	2309	5686	5581	5384	5496
contig_28	2007903	1985	2057	1968	1967	5216	5313	5189	5215	618354	434	365	359	1881	1967	1849	1864
contig_29	1544261	2120	2487	2115	2144	2129	2130	2117	2117	717281	2052	2085	2089	2095	1634	2076	1617

Como puede apreciarse, las rondas de pulido mejoraron significativamente la calidad del ensamble, con lo que puede proceder el andamiaje de la secuencia que vaya a ser seleccionada para su análisis.

Anexos

Comandos para los ensambles obtenidos

• Ensamble scf

#PBS -q ensam
#PBS -l nodes=1:ppn=20,mem=250gb,vmem=250gb,walltime=120:00:00
#PBS -N tricho_canu_2_200_ctrl
#PBS -V
module load canu/1.6
module load minimap2/2.12
cd /LUSTRE/usuario/atriztan/PacBioTricho/pacbio/control
canu -d . -p Trichoderma_atroviride_IMI_ctrl genomeSize=35M corOutCoverage=400 corMinCoverage=2 useGrid=false -pacbio-raw CR1_short.fasta  CR2_long.fasta  CR2_short.fasta  CR3_long.fasta

• Obtención de lecturas corregidas

#PBS -q ensam
#PBS -l nodes=1:ppn=20,mem=250gb,vmem=250gb,walltime=720:00:00
#PBS -N trichoderma_canu_cor_10_1000
#PBS -V
module load canu/1.8
module load java/1.8
module load minimap2/2.12
cd /home/vflores/LUSTRE/Trichoderma_atroviride_scaffolding/scaf/run_07
canu -correct -d . -p Trichoderma_atroviride_LANGEBIO genomeSize=35M corOutCoverage=1000 corMinCoverage=10 useGrid=false -pacbio-raw reads.fasta

• Ensamble v3

#PBS -q ensam
#PBS -l nodes=1:ppn=20,mem=250gb,vmem=250gb,walltime=120:00:00
#PBS -N trichoderma_wtdbg2_cor
#PBS -V
module load wtdbg2/2.1
cd /home/vflores/LUSTRE/Trichoderma_atroviride_scaffolding/scaf/run_07/wtdbg2_assembly
wtdbg2 --cpu 20 --input reads.fasta.gz --force --prefix Trichoderma_atroviride --kmer-fsize 0 --kmer-psize 21 --kmer-depth-max 1000 --kmer-depth-min 10 --kmer-subsampling 4 --aln-kmer-sampling 256 --dp-max-gap 4 --dp-max-var 4 --dp-penalty-gap -7 --dp-penalty-var -21 --aln-min-length 2048 --aln-min-match 200 --aln-max-var 0.2 --aln-dovetail 256 --aln-strand 3 --aln-maxhit 1000 --aln-bestn 500 --verbose --tidy-reads 2000 --node-len 1024 --node-ovl 256 --node-matched-bins 1 --node-drop 0.25 --edge-min 5 --node-min 5 --node-max 1000 --ttr-cutoff-depth 0 --ttr-cutoff-ratio 0.5 --dump-kbm Vanilla_SAGARPA_cor --bubble-step 40 --tip-step 10 --ctg-min-length 1000 --ctg-min-nodes 3 --bin-complexity-cutoff 2
wtpoa-cns -t 20 -i Trichoderma_atroviride.ctg.lay -f -o Trichoderma_atroviride.ctg.fasta -M 2 -X -5 -I -2 -D -4 -B 96 -W 200 -w 100 -A -R 16 -C 3 -F 0.5 -N 20 -v

• Ensamble v3.2

#PBS -q ensam
#PBS -l nodes=1:ppn=16,mem=720gb,vmem=720gb,walltime=72:00:00
#PBS -N trichoderma_canu_10_1000
#PBS -V
module load canu/1.8
module load java/1.8
module load minimap2/2.12
cd /home/vflores/LUSTRE/Trichoderma_atroviride_scaffolding/scaf/run_07/canu_assembly
canu -assemble -d . -p Trichoderma_atroviride_LANGEBIO genomeSize=35M corOutCoverage=1000 corMinCoverage=10 useGrid=false -pacbio-corrected reads.fasta.gz

• Ensamble v3.3 (nota, el ensamble v3.3.polish se obtiene directamente en este paso)

#PBS -q ensam
#PBS -l nodes=1:ppn=20,mem=250gb,vmem=250gb,walltime=120:00:00
#PBS -N trichoderma_minimap2_miniasm_racon_polish
#PBS -V
module load minimap2/2.12
module load miniasm/0.3
module load racon/1.3.1
cd /home/vflores/LUSTRE/Trichoderma_atroviride_scaffolding/scaf/run_07/racon_polish_assembly
minimap2 -x ava-pb -t 20 reads.fasta.gz reads.fasta.gz > minimap2_alignments.paf
miniasm -f reads.fasta.gz minimap2_alignments.paf > fragment_assembly.gfa
awk '$1 ~/S/ {print ">"$2"\n"$3}' fragment_assembly.gfa > fragment_reads.fasta
minimap2 -t 20 fragment_reads.fasta reads.fasta.gz > minimap2_fragment_assembly.paf
racon -t 20 reads.fasta.gz minimap2_fragment_assembly.paf fragment_reads.fasta > racon_contigs.fasta
minimap2 -t 20 racon_contigs.fasta reads.fasta.gz > minimap2_polish_assembly.paf
racon -t 20 reads.fasta.gz minimap2_polish_assembly.paf racon_contigs.fasta > racon_polished_contigs.fasta

• Pulido de secuencias con lecturas PacBio

#PBS -q ensam
#PBS -l nodes=1:ppn=20,mem=250gb,vmem=250gb,walltime=120:00:00
#PBS -N trichoderma_racon_polish
#PBS -V
module load minimap2/2.12
module load racon/1.3.1
cd /home/vflores/LUSTRE/Trichoderma_atroviride_scaffolding/scaf/run_07/racon_polish
for assembly in Trichoderma_atroviride_LANGEBIO_scf.fasta Trichoderma_atroviride_LANGEBIO_v3.fasta Trichoderma_atroviride_LANGEBIO_v3.2.fasta Trichoderma_atroviride_LANGEBIO_v3.3.fasta
do
	base_name=$(echo $assembly | perl -pe 's/\.fasta//')
  minimap2 -t 20 ${assembly} reads.fasta.gz > ${base_name}.paf
  racon    -t 20 reads.fasta.gz ${base_name}.paf ${assembly} > ${base_name}.polish.fasta
done

• Pulido de secuencias con lecturas Illumina

#PBS -q ensam
#PBS -l nodes=1:ppn=16,mem=240gb,vmem=240gb,walltime=120:00:00
#PBS -N trichoderma_ntedit
#PBS -V
cd /home/vflores/LUSTRE/Trichoderma_atroviride_scaffolding/scaf/run_07/illumina_polish
/home/vflores/bin/nthits -p tatro -b 36 -k 40 -t 16 --outbloom --solid R1P.fastq.gz R2P.fastq.gz
/home/vflores/bin/ntedit -t 16 -f Trichoderma_atroviride_LANGEBIO_scf.fasta -r tatro_k40.bf -b Trichoderma_atroviride_LANGEBIO_scf.ipolish -z 10000
/home/vflores/bin/ntedit -t 16 -f Trichoderma_atroviride_LANGEBIO_scf.polish.fasta -r tatro_k40.bf -b Trichoderma_atroviride_LANGEBIO_scf.polish.ipolish -z 10000
/home/vflores/bin/ntedit -t 16 -f Trichoderma_atroviride_LANGEBIO_v3.fasta -r tatro_k40.bf -b Trichoderma_atroviride_LANGEBIO_v3.ipolish -z 10000
/home/vflores/bin/ntedit -t 16 -f Trichoderma_atroviride_LANGEBIO_v3.polish.fasta -r tatro_k40.bf -b Trichoderma_atroviride_LANGEBIO_v3.polish.ipolish -z 10000
/home/vflores/bin/ntedit -t 16 -f Trichoderma_atroviride_LANGEBIO_v3.2.fasta -r tatro_k40.bf -b Trichoderma_atroviride_LANGEBIO_v3.2.ipolish -z 10000
/home/vflores/bin/ntedit -t 16 -f Trichoderma_atroviride_LANGEBIO_v3.2.polish.fasta -r tatro_k40.bf -b Trichoderma_atroviride_LANGEBIO_v3.2.polish.ipolish -z 10000
/home/vflores/bin/ntedit -t 16 -f Trichoderma_atroviride_LANGEBIO_v3.3.fasta -r tatro_k40.bf -b Trichoderma_atroviride_LANGEBIO_v3.3.ipolish -z 10000
/home/vflores/bin/ntedit -t 16 -f Trichoderma_atroviride_LANGEBIO_v3.3.polish.fasta -r tatro_k40.bf -b Trichoderma_atroviride_LANGEBIO_v3.3.polish.ipolish -z 10000

• Alineamiento de lecturas Illumina DNAseq sobre los ensambles construidos

for file_name in $(ls | grep fai$ | perl -pe 's/\.fai//')
do
  base_name=$(echo $file_name | perl -pe 's/\.fa$//;s/\.fasta$//')
  bwa index $file_name
  bwa mem -t 8 $file_name R1P.fastq.gz R2P.fastq.gz > ${base_name}.sam
	samtools view -@ 8 -h -b -o ${base_name}_tmp.bam ${base_name}.sam
	samtools sort -@ 8 -o ${base_name}.bam ${base_name}_tmp.bam
	samtools index ${base_name}.bam
	samtools view -f 12 -@ 8 -h -b -o ${base_name}_unmapped.bam ${base_name}.bam
	samtools view -f 3 -@ 8 -h -b -o ${base_name}_properly_paired.bam ${base_name}.bam
	samtools view ${base_name}_properly_paired.bam | cut -f1 | sort -V | uniq > ${base_name}_properly_paired.id_list
	samtools view ${base_name}_unmapped.bam | cut -f1 | sort -V | uniq > ${base_name}_unmapped.id_list
	total_reads=$(cat $base_name.id_list | wc -l | awk 'print $1*2')
	proper_shared_reads=$(grep -wFf ${base_name}_properly_paired.id_list Trichoderma_atroviride_IMI_206040_properly_paired.id_list | wc -l | awk '{print $1*2}')
	proper_exclusive_reads=$(echo -e "$total_reads\t$proper_shared_reads" | awk 'BEGIN{FS="\t"}{print $1-$2}')
	unmapped_shared_reads=$(grep -wFf ${base_name}_unmapped.id_list Trichoderma_atroviride_IMI_206040_unmapped.id_list | wc -l | awk '{print $1*2}')
	unmapped_exclusive_reads=$(echo -e "$total_reads\t$unmapped_shared_reads" | awk 'BEGIN{FS="\t"}{print $1-$2}')
	echo -e "$base_name\t$unmapped_shared_reads\t$unmapped_exclusive_reads\t$proper_shared_reads\t$proper_exclusive_reads" >> mapping_summary.tsv
done

• Alineamiento de secuencias de RNAseq usando hisat2

#PBS -q default
#PBS -N trichoderma_hisat2_mappings
#PBS -l nodes=1:ppn=16,mem=32gb,vmem=32gb,walltime=24:00:00
module load  hisat2/2.1.0
module load samtools/1.9
cd /home/vflores/LUSTRE/Trichoderma_atroviride_scaffolding/transcriptome
for base_name in
Trichoderma_atroviride_LANGEBIO_scf Trichoderma_atroviride_LANGEBIO_scf.polish Trichoderma_atroviride_LANGEBIO_scf.ipolish_edited Trichoderma_atroviride_LANGEBIO_scf.polish.ipolish_edited Trichoderma_atroviride_LANGEBIO_v3 Trichoderma_atroviride_LANGEBIO_v3.polish Trichoderma_atroviride_LANGEBIO_v3.2 Trichoderma_atroviride_LANGEBIO_v3.2.polish Trichoderma_atroviride_LANGEBIO_v3.2.ipolish_edited Trichoderma_atroviride_LANGEBIO_v3.2.polish.ipolish_edited Trichoderma_atroviride_LANGEBIO_v3.3 Trichoderma_atroviride_LANGEBIO_v3.3.polish Trichoderma_atroviride_LANGEBIO_v3.3.ipolish_edited Trichoderma_atroviride_LANGEBIO_v3.3.polish.ipolish_edited Trichoderma_atroviride_LANGEBIO_v3.4 Trichoderma_atroviride_LANGEBIO_v3.ipolish_edited Trichoderma_atroviride_LANGEBIO_v3.polish.ipolish_edited
do
	hisat2-build ${base_name}.fasta ${base_name}
  hisat2 -p 16 -q -x ${base_name} -U CT01.fastq.gz -S ${base_name}_CT01.sam
  samtools view -h -b -o ${base_name}_CT01_tmp.bam -@ 16 ${base_name}_CT01.sam
  samtools sort -l 9 -@ 16 -o ${base_name}_CT01.bam ${base_name}_CT01_tmp.bam
  samtools index ${base_name}_CT01.bam
done
rm -rf *.sam *_tmp.bam

• Selección de lecturas RNAseq que no alinean a los ensambles construidos

module load samtools/1.9
cd /home/vflores/LUSTRE/Trichoderma_atroviride_scaffolding/transcriptome
for base_name in
Trichoderma_atroviride_LANGEBIO_scf Trichoderma_atroviride_LANGEBIO_scf.polish Trichoderma_atroviride_LANGEBIO_scf.ipolish_edited Trichoderma_atroviride_LANGEBIO_scf.polish.ipolish_edited Trichoderma_atroviride_LANGEBIO_v3 Trichoderma_atroviride_LANGEBIO_v3.polish Trichoderma_atroviride_LANGEBIO_v3.2 Trichoderma_atroviride_LANGEBIO_v3.2.polish Trichoderma_atroviride_LANGEBIO_v3.2.ipolish_edited Trichoderma_atroviride_LANGEBIO_v3.2.polish.ipolish_edited Trichoderma_atroviride_LANGEBIO_v3.3 Trichoderma_atroviride_LANGEBIO_v3.3.polish Trichoderma_atroviride_LANGEBIO_v3.3.ipolish_edited Trichoderma_atroviride_LANGEBIO_v3.3.polish.ipolish_edited Trichoderma_atroviride_LANGEBIO_v3.4 Trichoderma_atroviride_LANGEBIO_v3.ipolish_edited Trichoderma_atroviride_LANGEBIO_v3.polish.ipolish_edited
do
	outbase_name=$(echo "$base_name" | perl -pe 's/Trichoderma_atroviride_LANGEBIO_/unmapped_/')
  samtools view -b -h -o ${outbase_name}_hisat2.bam -f4 ${base_name}_CT01.bam
	bamToFastq -i ${outbase_name}_hisat2.bam -fq ${outbase_name}_hisat2.fastq
	gzip -9 ${outbase_name}_hisat2.fastq
done
rm -rf *.sam *_tmp.bam

• Alineamiento de lecturas RNAseq sobre el genoma de referencia usando lecturas no mapeadas a los ensambles construidos

#PBS -q default
#PBS -N trichoderma_hisat2_mappings
#PBS -l nodes=1:ppn=16,mem=32gb,vmem=32gb,walltime=24:00:00
module load  hisat2/2.1.0
module load samtools/1.9
cd /home/vflores/LUSTRE/Trichoderma_atroviride_scaffolding/transcriptome
echo > base_table
for base_name in
scf scf.polish scf.ipolish_edited scf.polish.ipolish_edited v3 v3.polish v3.2 v3.2.polish v3.2.ipolish_edited v3.2.polish.ipolish_edited v3.3 v3.3.polish v3.3.ipolish_edited v3.3.polish.ipolish_edited v3.4 v3.ipolish_edited v3.polish.ipolish_edited
do
	hisat2-build Trichoderma_atroviride_IMI_206040.fasta Trichoderma_atroviride_IMI_206040
  hisat2 -p 16 -q -x Trichoderma_atroviride_IMI_206040 -U unmapped_${base_name}_hisat2.fastq.gz -S Trichoderma_atroviride_IMI_unmapped_${base_name}_hisat2.sam
  samtools view -h -b -o Trichoderma_atroviride_IMI_unmapped_${base_name}_hisat2_tmp.bam -@ 16 Trichoderma_atroviride_IMI_unmapped_${base_name}_hisat2.sam
  samtools sort -l 9 -@ 16 -o Trichoderma_atroviride_IMI_unmapped_${base_name}_hisat2.bam Trichoderma_atroviride_IMI_unmapped_${base_name}_hisat2_tmp.bam
  samtools index Trichoderma_atroviride_IMI_unmapped_${base_name}_hisat2.bam
	samtools idxstats Trichoderma_atroviride_IMI_unmapped_${base_name}_hisat2.bam > tmp_table
	echo "$(paste base_table tmp_table)" > base_table
done
rm -rf *.sam *_tmp.bam

Datos de calidad de las secuencias Illumina con las que se realizaron las rondas de pulido

Dataset	Forward	Reverse
Full	link	link
TRAILING:25 CROP:250	link	link
TRAILING:25 MINLEN:200 CROP:250	link	link
TRAILING:25 MINLEN:250	link	link